制備帶標記的RNA探針是RNA pull down實驗中最開始、也是最關鍵的步驟。

首先確定目標序列。根據實驗目的確定合適的RNA序列，可以是目標轉錄本的全部序列或部分序列；對照組通常采用反義序列，也可以是無關序列。如果目標序列小于100bp，建議直接合成帶標記的RNA，如果大于100bp，可以按照如下步驟體外轉錄獲得。

1. 制備帶有T7啟動子和目標序列的DNA模板。通過PCR或全基因合成方法獲得目標序列，例如測序驗證過的純化PCR產物或質粒。以此為模板，設計帶有T7啟動子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物，PCR分別獲得T7-正義鏈（實驗組）和T7-反義鏈（對照組）DNA模板并回收純化。

2. 體外轉錄得到標記的RNA探針。以帶有T7啟動子的DNA為模板，采用體外轉錄試劑盒進行轉錄，生成RNA。為了進行后續(xù)RNA pull down實驗，同時對RNA進行標記。

RNA pull down實驗常常采用生物素標記目標RNA，基于生物素與鏈霉親和素之間的強大親和力，用鏈霉親和素磁珠捕獲RNA探針的互作復合體。

生物素標記RNA的常見做法是在轉錄體系中加入生物素標記的UTP，邊轉錄邊標記，但標記效率會隨著序列的長度增加而逐漸下降，因此不同RNA序列獲得的探針量不穩(wěn)定。標記好的生物素RNA還需要純化以去除游離的生物素UTP，純化過程中也會有一些RNA損失。

為解決RNA探針標記的難題，輝駿生物研發(fā)了一種新的標記方法，利用一段只有16nt的RNA標簽“F2”來標記RNA。磁珠上偶聯(lián)的特異性配體與F2標簽具有強大的親和力，可以高效調取目標RNA。該方法的最大優(yōu)勢是：在構建DNA模板時即可以將F2與目標序列連接，省去了轉錄時的標記步驟，實現(xiàn)了100%標記，不僅可以標記線性RNA，還可以標記環(huán)狀RNA（circRNA），并能靈活的進行體內、體外標記。除此之外，省去了標記后的RNA純化步驟，避免了RNA損失、操作更加簡單，降低了成本。目前該方法已經獲得國家專利授權。

F2 RNA pull-down試劑盒使用案例

左：RNA pull down WB檢測圖（陽性）；    右：RNA pull down MS產物銀染圖

F2-RNA pull down試劑盒產品信息-輝駿生物

RNA pull down實驗—輝駿服務內容

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