免疫沉淀質(zhì)譜（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry, IP-MS）是研究蛋白質(zhì)相互作用、揭示蛋白質(zhì)作用機(jī)理的重要研究方法?；谝嘿|(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜（LC-MS）的蛋白鑒定，在多個(gè)科研領(lǐng)用中有著廣泛應(yīng)用，可以對目標(biāo)蛋白、蛋白混合物或相互作用蛋白進(jìn)行鑒定。

其在蛋白研究中應(yīng)用如下： （1）篩選目標(biāo)蛋白未知互作蛋白時(shí)：通過IP捕獲“目標(biāo)蛋白-結(jié)合蛋白”復(fù)合物，質(zhì)譜可獲得復(fù)合物中蛋白鑒定列表； （2）確認(rèn)目標(biāo)蛋白存在方面：①在非編碼RNA翻譯蛋白研究中，IP捕獲樣本“預(yù)測目標(biāo)蛋白”后，質(zhì)譜驗(yàn)證其存在性；②在蛋白表達(dá)研究中，則通過IP捕獲體外/體內(nèi)表達(dá)的目標(biāo)蛋白，質(zhì)譜確認(rèn)表達(dá)情況； （3）鑒定目標(biāo)蛋白修飾位點(diǎn)時(shí)：IP捕獲樣本中目標(biāo)蛋白，質(zhì)譜可精準(zhǔn)鑒定其修飾肽段及位點(diǎn)。

輝駿生物將為您介紹Co-IP方法制備的樣品進(jìn)行蛋白鑒定的全流程方案。 

01  實(shí)驗(yàn)原理

 蛋白質(zhì)被酶解成肽段，進(jìn)入質(zhì)譜儀，被離子化而帶上電荷，檢測得到各肽段的質(zhì)荷比（m/z），即一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)；肽段在質(zhì)譜儀中被進(jìn)一步破碎，得到各肽段碎片離子的質(zhì)荷比（m/z），即二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。用檢索軟件比對相應(yīng)的蛋白數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，導(dǎo)出蛋白的定性和定量數(shù)據(jù)。

圖1 IP-MS基本原理示意圖 

02  實(shí)驗(yàn)步驟 

實(shí)驗(yàn)大致流程：總蛋白提取→總蛋白與抗體孵育→proteinA/G磁珠與抗體結(jié)合→蛋白洗脫（變性/非變性）→質(zhì)譜測序→數(shù)據(jù)分析

1 總蛋白提取

（1）培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞，待細(xì)胞生長至合適密度，收集細(xì)胞；

（2）用預(yù)冷PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，加入300-500 μL預(yù)冷的IP裂解緩沖液（輝駿貨號(hào)為：FI8101），在IP裂解液中預(yù)先加入3-5 μL蛋白酶抑制劑（輝駿貨號(hào)為：FI8105），現(xiàn)用現(xiàn)配；

（3）4℃混勻儀上裂解30 min；

（4）為了更充分裂解，最好冰上超聲至溶液基本澄清；如果無超聲條件，可置于冰上裂解30 min，期間每10 min渦旋混勻一次，每次5 s；

（5）4℃離心機(jī)12000 rpm離心15 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中。

2 總蛋白與抗體孵育

（1）將余下蛋白樣本平分為IP實(shí)驗(yàn)組、IP對照組，實(shí)驗(yàn)組加入目標(biāo)蛋白的IP級(jí)別抗體，對照組加入Normal IgG抗體（與實(shí)驗(yàn)組抗體同源同型）；

（2）4℃孵育4 h或過夜。 

圖2 內(nèi)源性蛋白Co-IP實(shí)驗(yàn)分組圖

3 proteinA/G磁珠與抗體結(jié)合

（1）磁珠預(yù)處理：每組取25 μL proteinA/G磁珠（輝駿貨號(hào)為：FI8302），加入200 μL漂洗緩沖液（輝駿貨號(hào)為：FI8107），顛倒混勻30次； 

（2）放磁力架上靜置1 min，棄上清；

（3）重復(fù)上述洗滌步驟1次；

（4）向磁珠中加入蛋白樣本/抗體復(fù)合物，充分混勻，置于4℃混勻儀上孵育2 h；

（5）放磁力架上靜置1 min，棄上清，加入500 μL漂洗緩沖液，顛倒混勻30次； 

（6）放磁力架上靜置1 min，棄上清，重復(fù)上述洗滌步驟2次。

4 蛋白洗脫

4.1 變性洗脫 

（1）向磁珠中加入50 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液進(jìn)行洗脫，振蕩混勻后瞬離，95℃加熱5-10 min；

（2）放磁力架靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中，進(jìn)行上樣跑SDS-PAGE膠；

（3）將SDS-PAGE膠使用考染（MS效率更佳）或銀染（靈敏度更高），一般選擇考染；

（4）切膠條后可送輝駿生物進(jìn)行質(zhì)譜（MS）檢測。

4.2 非變性洗脫 

（1）向磁珠中加入40-50 μL洗脫緩沖液（輝駿貨號(hào)為：FI8102），渦旋振蕩20 s，放混勻儀上室溫洗脫10-15 min，渦旋振蕩20 s；

（2）1000 g離心20 s，放磁力架上靜置1 min，收集上清至新的1.5 mL EP管中；

（3）洗脫后的蛋白可直接送輝駿生物進(jìn)行質(zhì)譜（MS）檢測。

5 質(zhì)譜測序

通過質(zhì)譜（MS）技術(shù)對IP洗脫液中的蛋白成分進(jìn)行鑒定和分析，篩選誘餌蛋白的未知互作蛋白。

6 數(shù)據(jù)分析

找到關(guān)鍵hub蛋白。

 03  送樣建議 

1 只鑒定特定目標(biāo)蛋白

根據(jù)WB結(jié)果切對應(yīng)SDS-PAGE膠上目標(biāo)位置的條帶，避免切到其他條帶或空白膠。

2 鑒定產(chǎn)物中的全部蛋白

（1）非變性洗脫：酸性洗脫或競爭肽洗脫，洗脫液直接進(jìn)行液態(tài)酶解和質(zhì)譜；

（2）變性洗脫：①Loading buffer煮beads，跑膠再全泳道做質(zhì)譜（因?yàn)榧恿薼oading buffer的溶液沒辦法直接液態(tài)酶解）；②加PBS煮樣5-10 min洗脫蛋白，洗脫液可以液態(tài)酶解。

3 三種不同的洗脫方法，如何選擇？送溶液好還是膠條好？液態(tài)酶解的肽段回收率高于膠內(nèi)酶解，因此首選非變性洗脫或PBS煮樣洗脫送樣。但如有以下情況，可以選擇跑膠做質(zhì)譜：

（1）溶液樣品中含有不易去除且質(zhì)譜不兼容的物質(zhì)，比如溴酚藍(lán)、高比例甘油、高濃度離子型去污劑（SDS）等；

（2）有嚴(yán)重輕重鏈污染，可以跑膠后切除高豐度條帶；

（3）非變性洗脫率較低，洗脫產(chǎn)物的SDS-PAGE幾乎無條帶。

* 注意：（1）膠塊較大或條帶較多時(shí)，需要先將膠切成幾份，再分別酶解；（2）充分酶解能夠提高肽段回收率，增加蛋白鑒定數(shù)量，但會(huì)因此增加酶解費(fèi)用；（3）如果想降低成本，可以減小膠塊體積，例如跑較短的膠（1-2 cm）或濃縮膠。

04  質(zhì)譜鑒定*范圍 

輝駿生物可以檢測各種類型的蛋白樣本，例如蛋白溶液、干粉、膠條或斑點(diǎn)等，一次上機(jī)可以檢測到高達(dá)1000多種蛋白質(zhì)。以下列舉了可能應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜（LC-MS/MS）的幾個(gè)方向：（1）IP，Co-IP，pull-down類蛋白相互作用樣本（膠條或溶液）的鑒定；（2）細(xì)胞器，外泌體等簡單樣本的蛋白質(zhì)表達(dá)譜鑒定（全譜分析）。 

05  質(zhì)譜鑒定*服務(wù)優(yōu)勢 

輝駿生物旨在為客戶提供良好的質(zhì)譜鑒定服務(wù)，可以進(jìn)行幾乎所有感興趣的研究，如蛋白質(zhì)組分析、小分子的高分辨率分析、復(fù)雜環(huán)境中小分子的定量分析等。

01 近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，眾多服務(wù)案例，服務(wù)成果得到優(yōu)秀期刊認(rèn)可； 02 自有互作實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，對IP、pull-down等微量蛋白的鑒定有十足把控力； 03 可以提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣品制備、質(zhì)量控制、質(zhì)譜處理、生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)分析等全套服務(wù)內(nèi)容； 04 質(zhì)譜儀器先進(jìn)，操作人員技術(shù)成熟，鑒定準(zhǔn)確度和靈敏度高； 05 售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確保客戶安心進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿。